Western blot


Western blot (v české literatuře též označovaný jako imunoblot) je analytická technika používaná k detekci specifického proteinu ve směsi s dalšími proteiny, např. ve vzorku homogenátu tkáně či jiného biologického vzorku. Využívá gelovou elektroforézu k separaci proteinů podle jejich velikosti (denaturující SDS-PAGE), popř. podle jejich celkové trojrozměrné struktury (nativní elektroforéza). Následně jsou proteiny přeneseny („přeblotovány“) z gelu na povrch membrány (nejčastěji nitrocelulosové či PVDF), na jejímž povrchu jsou detekovány specifickými protilátkami.

Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale zato přesnější (větší specifičnost).

Metoda dostala své jméno Western blot jako slovní hříčka na podobnou metodu Southern blot používanou k detekci DNA a vyvinutou dříve Edwinem Southernem.

Obsah

Metodika Western blotu


SDS-PAGE

První část se skládá z klasické SDS-PAGE elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli podle své molekulové hmotnosti. Jednotlivé proteiny vytváří v gelu tzv. zóny (v laboratorním slangu tzv. bandy, z angl. proužky).

Přenos

Gel z elektroforézy se následně přiloží na PVDF či nitrocelulosovou membránu a pomocí blotovacího zařízení dojde působením elektrického proudu k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. Přístroj je realizován jako soustava anody (spodní díl) a katody (horní díl). Záporně nabité proteiny (obalené SDS) jsou elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů, tj. na povrch membrány).

Blokování

Povrch membrány je nutné tzv. zablokovat, neboť povrch membrány váže proteiny, tj. jak antigen, tak i následně přidané protilátky. Blokování těchto nespecifických míst se nejčastěji provádí umístěním membrány do zředěného roztoku nějakého levného proteinu - např. 3 - 5 % BSA či netučné suché mléko v TBS, s přídavkem slabého detergentu jako je Tween 20 (0,05%). Proteiny BSA či mléčného kaseinu z roztoku se naváží na všechna místa, kam se dosud nenavázaly proteiny při přenosu. Po přidání protilátky se už molekuly imunoglobulinů nemohou nespecificky navázat na prázdný povrch membrány, ale musí specificky „hledat“ svůj epitop na přeblotovaných antigenech. Blokováni výrazně snižuje šum pozadí a odstraňuje falešné pozitivity.

Detekce

Pro zviditelnění daného proteinu je nutné použití specifické protilátky proti tomuto proteinu. Existují dva základní principy detekce, buď dvoukrokový (kombinace primární protilátky a sekundární protilátky konjugované s reportérovým enzymem) či jednokrokový (s reportérovým enzymem je konjugována přímo primární protilátka).

Po blokování je membrána přenesena do zředěného roztoku primární protilátky (o koncentraci typicky 0,5 - 5 μg/ml) v pufrovaném roztoku (např. TBS či PBS) BSA či mléčného kaseinu. Inkubace s primární protilátkou probíhá za mírného míchání, po dobu od 1 hod. až přes noc, za laboratorní teploty či při 4 °C.

Po opláchnutí membrány pufrovaným roztokem detergentu (např. PBS+ 0,05% Tween 20) je membrána přenesena do roztoku sekundární protilátky - komerčně dodávané protilátky proti celé škále primárních protilátek, nejčastěji jsou to sekundární protilátky proti myším či králičím proteinům (což jsou skoro vždy primární protilátky). Tyto sekundární protilátky vázající primární protilátky jsou konjugovány s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci - např. křenovou peroxidasou (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či alkalickou fosfatázou (AP, z angl. alcalic phosphatase).

Při jednokrokové detekci je reportérovým enzymem značena přímo primární protilátka - většinou se tedy jedná o komerčně dodávané primární protilátky proti často používaným proteinům či tagům, např. proti proteinu GFP, či FLAG-tagu, hemaglutininovému (HA) tagu, His-tagu apod.

Vyvolání

Výhody a nevýhody Western blotu


Využití Western blotu


Použitá literatura











Kategorie: Imunologické metody




Poslední aktualizace: 20.02.2021 06:32:14 CET

Zdroj: Wikipedia (autoři [Dějiny])    licence: CC-by-sa-3.0

Změny: Všechny obrázky a většina návrhových prvků, které s nimi souvisejí, byly odstraněny. Některé ikony byly nahrazeny FontAwesome-Icons. Některé šablony byly odstraněny (např. „Článek potřebuje rozšíření“) nebo byly přiřazeny (např. „Poznámky“). Třídy CSS byly buď odstraněny, nebo harmonizovány Byly odstraněny konkrétní odkazy na Wikipedii, které nevedou k článku nebo kategorii (jako „Redlinks“, „links to edit page“, „links to portals“). Každý externí odkaz má další obrázek. Kromě několika drobných změn designu byly odstraněny mediální kontejnery, mapy, navigační krabice, mluvené verze a geomikroformáty.

Upozornění Protože daný obsah je v daném okamžiku automaticky převzat z Wikipedie, ruční ověření bylo a není možné. LinkFang.org proto nezaručuje přesnost a aktuálnost získaného obsahu. Pokud existují informace, které jsou v tuto chvíli chybné nebo mají nepřesné zobrazení, neváhejte a kontaktujte nás: e-mail.
Viz také: Tiráž & Ochrana dat.